Der Zweck der zweiten Stufe der bakteriologischen Methode: Gewinnung einer Reinkultur von Mikroorganismen und deren Anreicherung. Führen Sie dazu Folgendes aus:

· Makroskopische Untersuchung von Kolonien im Durchlicht und im reflektierten Licht (Eigenschaften von Größe, Form, Farbe, Transparenz, Konsistenz, Struktur, Kontur, Oberfläche der Kolonien).

· Mikroskopische Untersuchung isolierter Kolonien und anschließende Vorbereitung und Untersuchung von Abstrichen dieser Kolonien.

· Aussaatkolonien charakteristisch für bestimmter Typ, auf Reinkultur-Akkumulationsmedien oder selektiven Medien und Inkubation unter optimalen Bedingungen.

Die kulturellen Eigenschaften von Mikroben werden durch die Art ihres Wachstums auf Nährmedien bestimmt. Da sie für jede Mikrobenart konstant sind, sind sie ein wichtiges diagnostisches Zeichen.

Bei der Isolierung einer Reinkultur eines Mikroorganismus sollten Sie auf das Wachstumsmuster des Mikroorganismus achten, d. h. über kulturelle Merkmale als eines der Merkmale, die die Identifizierung der Gattung oder Art des Mikroorganismus ermöglichen. Bei der Kultivierung einer Mikrobe in flüssigen Medien kann Bakterienwachstum in Form von Folgendem beobachtet werden:

a) diffuse Trübung;

b) Boden- und Wandwachstum in einem transparenten Medium;

c) Oberflächenfilm;

d) „ein Klumpen Watte“.

In halbflüssigen Medien kann man Folgendes beobachten:

a) diffuses Wachstum um die Impfung herum (bewegliche Bakterien);

b) Wachstum im Verlauf der Injektion (unbewegliche Bakterien);

c) Platzen des Mediums oder Bildung von Gasblasen.

Auf dichten Medien wird Folgendes beobachtet:

a) Wachstum in getrennten Kolonien;

b) Wachstum in kontinuierlicher Blüte.

Wachstum von Mikroben auf einem festen Nährmedium. Um die Eigenschaften von Kolonien zu untersuchen, werden Mikroben auf festen Nährböden in Petrischalen kultiviert. Bei der Aussaat von Material wird versucht, ein isoliertes Wachstum der Kolonien zu erreichen.

Aufgrund der Art der Kolonien werden folgende Typen unterschieden:

· S-Typ (aus dem Englischen glatt – glatt) – Kolonien zeichnen sich durch eine runde und konvexe Form, glatte Oberfläche und feuchte Konsistenz aus;

· Kolonien vom Typ R (aus dem Englischen „rough“ – rau) zeichnen sich durch eine raue Oberfläche, unregelmäßige Kanten und eine trockene Konsistenz aus. Sie entstehen durch Mutationen aus glatten S-Formen. Während der Dissoziation wird der Übergang von S-Formen zu R-Formen beobachtet. Das Phänomen der Dissoziation in pathogene Mikroben beobachtet unter dem Einfluss von Antibiotika und Chemotherapie, spezifischen Immunfaktoren, die während des Infektionsprozesses gebildet werden, sowie Umweltfaktoren.

· Zusätzlich zu diesen beiden Haupttypen von Kolonien gibt es einen schleimigen M-Typ (vom lateinischen mucus – schleimig), der sich durch eine zähe, schleimige Konsistenz auszeichnet. Entsteht bei der Dissoziation von Bakterienkulturen.

Bakterien jeder Art bilden Kolonien mit verschiedene Zeichen. Ihr Charakter wird mit bloßem Auge im Durchlicht und Auflicht sowie mit einer Lupe oder einem Mikroskop bei geringer Vergrößerung untersucht. Drehen Sie zu Beginn der Studie den Tassenboden zu sich und untersuchen Sie die Tassen im Durchlicht. Wenn es verschiedene Kolonien gibt, wird jede einzeln nummeriert und beschrieben. Das Protokoll weist auf die folgenden Merkmale hin.

1. Größe der Kolonien bestimmt durch seinen Durchmesser (groß – mit einem Durchmesser von 4–6 mm oder mehr, mittel – 2–4 mm, klein – 1–2 mm und punktförmig – weniger als 1 mm).

2. Form der Kolonien(regelmäßig rund, unregelmäßig amöbenförmig, rosettenförmig, rhizoid-wurzelförmig, erinnert an ineinander verschlungene Baumwurzeln usw.).

3. Grad der Transparenz(undurchsichtig, durchscheinend, transparent).

4. Koloniestruktur. Aufgrund der Art der Struktur werden folgende Arten von Kolonien unterschieden:

· hyaline – farblos, transparent, ohne spezifische sichtbare Struktur;

· körnig, das je nach Korngröße in fein- und grobkörnig unterteilt wird;

· fadenförmig oder faserig, gekennzeichnet durch das Vorhandensein langer, dicht miteinander verflochtener Fäden in der Dicke der Kolonie. Kolonien können homogen oder heterogen sein. Die Struktur der ersteren ist in allen Teilen gleich, während sich bei den letzteren der zentrale Teil vom peripheren unterscheidet oder einzelne Sektoren eine andere Struktur als die übrige Masse aufweisen.

5. Koloniefarbe wird durch das von der mikrobiellen Kultur produzierte Pigment bestimmt. Die überwiegende Mehrheit der pathogenen Bakterien produziert kein Pigment, weshalb ihre Kolonien farblos oder milchig-trüb sind, ähnlich wie Opal. Im Durchlicht sind solche Kolonien mehr oder weniger transparent. Pigmentbildende Mikrobenarten produzieren Kolonien in verschiedenen Farben: Creme, Gelb, Goldorange, Blau, Rot, Lila, Schwarz usw.

6. Oberflächencharakter(rau, glänzend, matt, trocken, nass, glatt, radial oder konzentrisch gestreift).

7. Die Beschaffenheit der Kantenkontur. Es gibt glatte Kanten in Form einer klar definierten Linie und unebene. Letztere sind unterteilt in:

· Wellenschliff, bestehend aus großen, leicht abgerundeten oder abgeflachten Zähnen von regelmäßiger Form;

· eine gewellte Kante, die sich etwas von einer gezackten Kante dadurch unterscheidet, dass ihre großen Zähne nicht klar definiert sind;

· erodierte oder gezackte Kante, bestehend aus scharfen Zähnen unterschiedlicher Größe und Form;

· Fransenrand mit zarten Fasern. In einigen Fällen gibt es keine klar definierte Linie, die die Kolonie von der Oberfläche des Mediums abgrenzt. Dieser Rand der Kolonie wird als diffus bezeichnet.

8. Erleichterung gekennzeichnet durch seine Höhe über der Oberfläche des Nährmediums und die Kontur der Form im Vertikalschnitt. Es gibt Reliefs, die konvex, vertieft, flach, kegelförmig, kuppelförmig, flach mit kegelförmiger Mitte, mit verdickten walzenförmigen Kanten usw. sind.

9. Koloniekonsistenz, das seinen physikalischen Zustand bestimmt, wird untersucht, indem man mit einer bakteriologischen Schleife mit einer Bakterienschleife einen Teil des Materials berührt oder davon abnimmt. Je nach Beschaffenheit der Kolonie gibt es:

pastös, lässt sich leicht entfernen und erodiert über die Oberfläche des Nährmediums Butter;

zähflüssig oder schleimig, klebend und hinter einer Schlaufe herabhängend

· faserig oder ledrig, dicht, von der Oberfläche des Nährmediums in Form eines elastischen Films entfernt, der der Größe und Form der Kolonie entspricht;

· Zerbrechliche, trockene, bröckelnde Schlaufen bei Berührung.

Kolonien einiger Bakterienarten wachsen in die Dicke des Nährmediums hinein, die ebenfalls durch eine bakteriologische Schleife bestimmt wird.

10. Geruch- ein weniger wichtiges Zeichen von Kolonien, da die Assoziationen, die es hervorruft, subjektiv sind. Viele Bakterienarten setzen beim Wachstum auf Nährböden spezifische Aromastoffe frei. Insbesondere Kulturen von Pseudomonas aeruginosa riechen nach Karamell, Kulturen von Listeria nach Molke, Nocardia nach frisch gegrabener Erde und Proteus nach fauligem Geruch.

III. Planen praktische Arbeit

1. Untersuchen Sie die kulturellen Eigenschaften von auf MPA gezüchteten Kolonien (Überprüfung der in der vorherigen Lektion erzeugten Pflanzen).

2. Screening der isolierten Kolonie (Reinkultur) (in Streifen) auf das Akkumulationsmedium (Steigungs-MPA)

3. Studieren und skizzieren Sie die Wachstumsmuster verschiedener Bakterien auf einfachen und komplexen Nährmedien

4. Füllen Sie die Tabelle „Klassifizierung der Mikroorganismen nach Art der Atmung“ aus.

5. Situationsprobleme lösen

Eine wichtige Phase der bakteriologischen Forschung ist die Kultur. Abhängig vom Zweck der Studie, der Art der Saatgut und Medien verwenden unterschiedliche Aussaatmethoden. Sie alle beinhalten ein zwingendes Ziel: den Hund vor fremden Mikroben zu schützen. Daher sollte zügig gearbeitet werden, jedoch ohne plötzliche Bewegungen, die die Luftvibrationen verstärken. Während der Aussaat kann man nicht sprechen. Die Aussaat erfolgt am besten in einer Kiste (bei der Arbeit mit infektiösem Material sind persönliche Sicherheitsregeln zu beachten).

Phasen der Isolierung reiner Kultur:

Tag 1 – Gewinnung isolierter Kolonien. Mit einer Öse, einer Pipette oder einem Glasstab wird ein Vorrat des Testmaterials auf die Oberfläche des Agars in einer Petrischale aufgetragen. Mit dem Spatel wird das Material in die Oberfläche des Mediums eingerieben; Ohne zu verbrennen oder den Spatel umzudrehen, erst in der 2. und dann in der 3. Tasse aussäen. Bei einer solchen Aussaat enthält der 1. Becher viel Material und dementsprechend viele Mikroben, der 2. Becher weniger und der 3. Becher noch weniger.

Isolierte Kolonien können durch Schleifensaat gewonnen werden. Dazu wird das Untersuchungsmaterial in Brühe oder isotonischer Natriumchloridlösung emulgiert.

Tag 2 – Untersuchen Sie das Wachstum von Mikroben auf Tellern. Im 1. Becher findet in der Regel ein kontinuierliches Wachstum statt – es wird nicht möglich sein, eine isolierte Kolonie zu isolieren. Auf der Oberfläche des Agars in der 2. und 3. Platte wachsen isolierte Kolonien. Sie werden mit bloßem Auge, mit einer Lupe, bei geringer Vergrößerung eines Mikroskops und manchmal in einem Stereomikroskop untersucht. Die gewünschte Kolonie wird vom Boden der Schale aus markiert und erneut auf eine Agar-Schrägfläche beimpft. Die Pflanzen werden in einen Thermostat gestellt. (Nur isolierte Kolonien können erneut ausgesät werden.)

Tag 3 – Studieren Sie das Wachstumsmuster auf Agar-Schrägagar. Sie machen einen Abstrich, färben ihn und beginnen, sie zu studieren, um sicherzustellen, dass die Kultur rein ist. Hier endet die Isolation der Reinkultur. Eine aus einer bestimmten Quelle isolierte und untersuchte Kultur wird als „Stamm“ bezeichnet.

Bei der Isolierung einer Reinkultur aus Blut (Hämokultur) wird diese zunächst in einem flüssigen Medium „gezüchtet“: 10-15 ml steril entnommenes Blut werden in 100-150 ml flüssiges Medium geimpft. Dies geschieht, weil sich im Blut normalerweise nur wenige Mikroben befinden. Das Verhältnis von beimpftem Blut zu Nährmedium 1:10 ist kein Zufall – so wird eine Blutverdünnung erreicht (unverdünntes Blut wirkt sich schädlich auf Mikroorganismen aus). Die beimpften Kolben werden in einen Thermostat gestellt. Nach einem Tag (manchmal auch nach einer längeren Zeit, abhängig von der zu isolierenden Kultur) wird der Inhalt der Kolben auf Platten beimpft, um isolierte Kolonien zu erhalten. Bei Bedarf die Aussaat im Abstand von 2-3 Tagen wiederholen.

Bei der Isolierung einer Reinkultur aus Urin, Magenspülung und anderen Flüssigkeiten werden diese zunächst unter aseptischen Bedingungen zentrifugiert und das Sediment beimpft. Die weitere Isolierung der Reinkultur erfolgt in üblicher Weise.

Wahlmedien werden häufig zur Isolierung reiner Kulturen verwendet. Eine Reihe von Methoden verwenden biologische Merkmale Mikrobe freigesetzt. Beispielsweise werden bei der Isolierung sporenbildender Bakterien die Pflanzen 10 Minuten lang auf 80 °C erhitzt, wodurch die vegetativen Formen abgetötet werden. Bei der Isolierung des gegen Säuren und Laugen resistenten Erregers der Tuberkulose mit Hilfe dieser Stoffe wird das Saatgut von Begleitstoffen befreit! Flora. Um Pneumokokken und Pestbazillen zu isolieren, wird das untersuchte Material weißen Mäusen injiziert – in ihrem Körper, der sehr empfindlich auf diese Krankheitserreger reagiert, würden sich diese Mikroben schneller vermehren als andere.

Bei Forschungsarbeiten, insbesondere im Gen-; In der wissenschaftlichen Forschung ist es notwendig, jeweils eine Kultur aus einer Zelle zu gewinnen. Eine solche Kultur wird „Klon“ genannt.] Um sie zu erhalten, wird am häufigsten ein Mikromanipulator verwendet – ein Gerät, das mit Instrumenten (Nadeln, Pipetten) von mikroskopischer Größe ausgestattet ist. Mit einem Halter unter der Kontrolle eines Mikroskops werden sie in das „B-Hundertstel-Tropfen“-Präparat eingeführt, die gewünschte Zelle (eine) entnommen und in ein Nährmedium überführt.

Untersuchung ausgewählter Kulturpflanzen

Untersuchung der Morphologie, Motilität, Farbeigenschaften und Wachstumsmuster auf Medien (kulturelle Eigenschaften);! enzymatische Aktivität und eine Reihe weiterer Funktionen! Die geteilte Mikrobe ermöglicht uns die Festlegung ihrer taxonomischen | Irgendeine Position, d.h. den Mikroorganismus klassifizieren: op| Teilen Sie es in Gattung, Art, Typ, Subtyp und Sorte ein. Dies nennt man „Identifikation“. Identifizierung von Mikroorganismen| mov ist für die Diagnose von Infektionen sehr wichtig, die Quellen und Übertragungswege wurden in einer Reihe anderer wissenschaftlicher Studien ermittelt.

REINE KULTUREN ERHALTEN.

Eine Reinkultur von Mikroben ist eine Population von Mikroorganismen einer Art, die aus einer isolierten Mikrobenkolonie stammt. Unter einer mikrobiellen Kolonie versteht man die Nachkommen von Bakterien, die aus der Vermehrung einer mikrobiellen Zelle entstehen.

Die Isolierung einer Reinkultur von Mikroben ist ein obligatorischer Schritt jeder bakteriologischen Untersuchung. Für die Untersuchung morphologischer, kultureller, biochemischer und antigener Eigenschaften ist eine Reinkultur erforderlich, deren Gesamtheit die Art des untersuchten Mikroorganismus bestimmt.

Es wurden viele Vorschläge gemacht, Reinkulturen von Mikroben aus Materialien zu isolieren, die reichlich gemischte Mikroflora enthalten. verschiedene Methoden. Am weitesten verbreitet Methode zur mechanischen Trennung von Mikroorganismen, befindet sich im Untersuchungsmaterial, um isolierte Kolonien an der Oberfläche oder in der Tiefe des Nährmediums zu erhalten. Wahlnährmedien werden häufig verwendet, um die Entwicklung derjenigen Mikroorganismen zu stimulieren, deren Reinkultur isoliert werden soll. Einige Mikrobenarten reagieren sehr empfindlich auf bestimmte Umweltfaktoren. Die individuelle Resistenz von Mikroben gegen den einen oder anderen Faktor wurde genutzt, um Methoden zur Isolierung reiner Kulturen durch Abtöten der begleitenden Mikroflora zu entwickeln. Mit dieser Methode werden Sporenformen von Mikroben isoliert, die gegen hohe Temperaturen resistent sind.

Es sind relativ wenige Methoden bekannt, Bakterien als Reinkulturen zu isolieren. Dies geschieht am häufigsten durch die Isolierung einzelner Zellen auf einem festen Nährmedium mithilfe der Streak-Plating-Methode.

Identische Kolonien wachsen normalerweise aus einer Reinkultur, und die Mikroskopie zeigt ähnliche Zellen, insbesondere in Bezug auf Größe und Gram-Färbung. Allerdings sind Ausnahmen möglich, zum Beispiel können Kolonien, die aus einer Reinkultur wachsen, glatt (S) oder rau (R) sein. Darüber hinaus können in Reinkulturen verschiedener Mikroorganismen kokkoide Zellen, Zysten und Sporen auftreten. Schließlich weisen einige Mikroorganismen eine Grammvariabilität auf.

Aussaat mit einem Schlaganfall. Es gibt viele Methoden zum Ausstreichen von Platten mit festen Medien („Striking Plates“), aber nur wenige davon erzeugen fast immer gut isolierte Kolonien, selbst wenn der Experimentator nicht über die nötigen Fähigkeiten verfügt. Alternativ können verdünnte Mischkulturlösungen auf die Oberfläche fester Medien in Platten gegossen werden.

Bei der Arbeit mit Anaerobiern werden „geschlüpfte Schalen“ oder Schalen, in die unter Luftatmosphäre eine Flüssigkultur eingebracht wird, anschließend in einem Anaerostaten inkubiert. Anaerobier benötigen frisch zubereitete Medien und die Ausstreichung sollte innerhalb der ersten 4 Stunden nach dem Autoklavieren erfolgen, um eine Ansammlung von gelöstem Sauerstoff zu vermeiden.

1. Zum Markieren Rückseite Zeichnen Sie mit einem Bleistift den Buchstaben T in die Petrischale und teilen Sie den Boden in drei Sektoren.

2. Mit einer Zick-Zack-Schleife mit der Kultur werden Streifen auf die Oberfläche des Agars in Sektor 1 aufgetragen. Dazu wird zunächst der Deckel der Schale angehoben und nach dem Auftragen des Streifens diese sofort geschlossen. Die Öse wird in einer Flamme sterilisiert und abkühlen gelassen (15 s).

3. Zeichnen Sie eine Schleife entlang der Oberfläche des Mediums in Sektor 1 und führen Sie dann sofort Zickzackstriche auf der Oberfläche des Mediums in Sektor 2 aus. Erhitzen Sie die Schleife in der Flamme und lassen Sie sie abkühlen.

4. Zeichnen Sie eine Schleife entlang der Oberfläche des Mediums in Sektor 2 und führen Sie damit dann Zick-Zack-Striche auf der Oberfläche des Mediums in Sektor 3 aus.

5. Inkubieren Sie die Schalen kopfüber, damit kein Kondenswasser vom Deckel auf die Oberfläche des Agars fällt. Im Sektor 1 wachsen zahlreiche Kolonien, während in den Sektoren 2 und 3 einzelne, gut isolierte Kolonien auftreten.

Gewinnung einer Reinkultur durch Sieben in die Tiefe des Mediums (nach Koch). Drei Reagenzgläser mit jeweils 15 ml Fleischpepton-Agar werden in ein Wasserbad gestellt, um den Agar zu schmelzen. Das geschmolzene Medium wird auf eine Temperatur von 43–45 °C abgekühlt. Eine Bakterienschleife des Testmaterials wird in das Reagenzglas eingeführt. Um das Material besser mit dem Medium zu vermischen, drehen Sie das beimpfte Reagenzglas mehrmals und halten Sie es zwischen Ihren Handflächen. Anschließend wird der Inhalt des 1. Reagenzglases mithilfe einer kalzinierten und gekühlten Schleife in das 2. und auf die gleiche Weise vom 2. in das 3. Reagenzglas überführt. Vorbereitete Mikrobenverdünnungen werden aus Reagenzgläsern in sterile Petrischalen gegossen, die mit Nummern gekennzeichnet sind, die den Nummern der Reagenzgläser entsprechen. Nachdem das Medium mit dem Testmaterial geliert ist, werden die Becher in einen Thermostat gestellt. Die Anzahl der Kolonien in den Kulturmediumplatten nimmt mit der Verdünnung des Materials ab.

Isolierung reiner Kultur mit der Drigalski-Methode. Das geschmolzene Nährmedium wird in drei Petrischalen gegossen. Das gefrorene Medium muss getrocknet werden, da seine feuchte Oberfläche die Bildung von Verschmelzungswachstum fördert. Ein Tropfen des Testmaterials wird in die erste Tasse gegeben und mit einem sterilen Spatel in die Oberfläche des Nährmediums eingerieben. Anschließend wird der Spatel, ohne den Spatel durchzubrennen oder neues Material anzusammeln, in den zweiten und dritten Becher überführt und das restliche Material darauf in die Oberfläche des Nährmediums gerieben. Die von Drigalsky vorgeschlagene Oberflächensiebmethode ist die am häufigsten verwendete Methode zur Gewinnung einer Reinkultur von Mikroben. Anstelle eines Spatels können Sie auch eine Schlaufe verwenden. Das Material auf dem Nährmedium wird in parallelen Strichen in einer Richtung im gesamten Becher verteilt. Anschließend werden durch Drehen des Bechers um 180° Striche in der Richtung senkrecht zu den ersten Strichen ausgeführt. Bei dieser Aussaatmethode wird das Material auf der Schlinge nach und nach verbraucht und einzelne Mikrobenkolonien wachsen entlang der am Ende der Aussaat gezogenen Gitterlinien.

Es sind relativ wenige Methoden bekannt, Bakterien als Reinkulturen zu isolieren. Dies geschieht am häufigsten durch die Isolierung einzelner Zellen auf einem festen Nährmedium mithilfe der Streak-Plating-Methode oder durch das Gießen einer kleinen Menge flüssiger Kultur in Platten ( Grenzverdünnungsmethode). Der Erhalt einer separaten Kolonie garantiert jedoch nicht immer die Reinheit der Kultur, da Kolonien nicht nur aus einzelnen Zellen, sondern auch aus deren Clustern wachsen können. Wenn Mikroorganismen Schleim bilden, haften oft Fremdkörper daran an. Für die Reinigung wird vorzugsweise ein nicht-selektives Medium (NSM) verwendet, da kontaminierende Mikroorganismen darauf besser wachsen und leichter nachweisbar sind.

Die Gewinnung isolierter Kolonien auf einem festen Nährmedium erfolgt entweder durch Sieben einer Mikroorganismensuspension mit einem Spatel ( Koch-Methode) oder unter Verwendung einer bakteriologischen Schleife ( Erschöpfungsschlagmethode). Durch die mechanische Trennung von Mikroorganismenzellen kann aus jeder Zelle eine isolierte Kolonie einer Mikrobenart entstehen.

Sieben mit einem Spatel (Koch-Methode) in folgender Reihenfolge produziert:

1) ein Tropfen einer Anreicherungskultur wird mit einer sterilen Pipette auf die Oberfläche des Nährmediums in Schale Nr. 1 aufgetragen und mit einem sterilen Spatel verteilt;

2) Nehmen Sie den Spatel heraus, schließen Sie schnell den Becher und geben Sie den Spatel in Becher Nr. 2, ohne ihn zu sterilisieren. Simulieren Sie die Verteilung der Kultur über die gesamte Oberfläche des Mediums, indem Sie die Oberfläche mit derselben Seite des Spatels berühren, die zuvor zum Verteilen der Probe verwendet wurde.

3) In Becher Nr. 3 werden genau die gleichen Aktionen ausgeführt, wonach der Spatel sterilisiert wird;

4) Die beimpften Schalen werden in einen Thermostat gestellt und bei optimaler Temperatur inkubiert.

Nach einer gewissen Zeit werden die Becher vom Thermostat entfernt und das Wachstum der Mikroorganismen untersucht. Normalerweise wird im Becher Nr. 1 ein kontinuierliches Bakterienwachstum beobachtet, und in den nachfolgenden Bechern werden Kolonien festgestellt.

Schlaufensiebung (Entwässerungsstreifenverfahren) Dabei wird eine bakteriologische Schleife aus einer Anreicherungskultur auf die Oberfläche eines Agarmediums in Petrischalen gesät. In der ersten Phase wird eine Reihe paralleler Striche mit einer Kulturschleife auf dem Agarmedium ausgeführt (Abbildung 4.2, A). Die Öse wird sterilisiert, auf dem nicht beimpften Teil des Agarmediums abgekühlt und eine Reihe von Hüben in senkrechter Richtung zu den ersten ausgeführt (Abbildung 4.2, B). Anschließend wird die Schlaufe erneut sterilisiert, abgekühlt und in die entsprechende Richtung gestrichelt IN(Abbildung 4.2) und nach der nächsten Sterilisation - in die Richtung G(Abbildung 4.2). Die Tassen werden in einen Thermostat gestellt und nach einer gewissen Zeit werden die Ergebnisse berücksichtigt. Normalerweise auf den Schlägen A Und B Während der Schläge wächst eine große Anzahl von Kolonien (manchmal kontinuierliches Wachstum). IN Und G Es bilden sich vereinzelte Kolonien.

Abbildung 4.2 – Schema der Streifensiebung von Bakterien, um isolierte Kolonien zu erhalten

Reihenverdünnungen in festem Medium- die einfachste Methode zur Aussaat von Platten, die darin besteht, dass nach dem Beimpfen der Probe in ein Reagenzglas mit sterilem geschmolzenem und abgekühltem Agar das Medium gemischt, in eine Petrischale gegossen und aushärten gelassen wird. Um gut isolierte Kolonien zu erhalten, bereiten Sie eine Reihe aufeinanderfolgender zehnfacher Verdünnungen vor und geben Sie 1 ml der Proben direkt in den Becher, fügen Sie 15–20 ml geschmolzenes Agarmedium hinzu und mischen Sie durch Schütteln des Bechers. Manchmal bleiben einzelne Kolonien im Agar hängen und können nur mechanisch entfernt werden. Schlimm ist auch, dass die Bakterien einige Zeit in einer Umgebung mit der Temperatur von geschmolzenem Agar verbringen.

Isolierung der Reinkultur

Die wichtigste Methode zur Isolierung reiner Bakterienkulturen ist die von R. Koch vorgeschlagene Methode, deren Prinzip darin besteht, aus isolierten Kolonien eine Bakterienkultur zu gewinnen. Bei der Isolierung einer reinen Aerobierkultur wird die Anreicherungskultur bzw. das Untersuchungsmaterial auf ein festes Nährmedium ausgesät. Der Betriebsablauf ist wie folgt. Das geschmolzene Nährmedium wird in sterile Petrischalen gegossen. Nach dem Aushärten des Mediums wird ein Tropfen des Testmaterials auf dessen Oberfläche aufgetragen und mit einem sterilen Drigalsky-Spatel zunächst auf einer Seite der Oberfläche des Nährmediums in einer Petrischale und dann auf der anderen Seite verteilt. Wischen Sie mit demselben Spatel die Oberfläche des dichten Mediums in der 2., 3. und 4. Tasse ab. Die Schalen werden bei der für Mikroben optimalen Temperatur (meistens 37 °C) bis zu 2 Tage lang inkubiert. Typischerweise wird in den ersten beiden Schalen nach der Inkubation ein kontinuierliches Wachstum der Mikroben beobachtet, während in den nachfolgenden Schalen isolierte Kolonien beobachtet werden.

Die Anreicherungskultur kann mit der Verdünnungsstreifenmethode dispergiert werden. Dabei wird die Anreicherungskultur bzw. deren Verdünnung mit einer Öse selektiert und in einer bestimmten Reihenfolge Streifen durch ein dichtes Nährmedium in einer Petrischale gezogen. Vor jedem neuen Hub wird die Schlinge sterilisiert. Abhängig von der Wachstumsrate des Mikroorganismus werden die Schalen 1–7 Tage lang thermostatisiert. Die gewachsenen isolierten Kolonien werden mit der Ausstrichmethode in Reagenzgläsern auf die Oberfläche eines Schrägmediums oder in ein flüssiges Medium gescreent.

Isolierte Kolonien von Anaerobiern und fakultativen Anaerobiern werden durch Tiefeninokulation gewonnen. Dazu werden Reagenzgläser mit 0,5-1,0 ml einer Verdünnung des Untersuchungsmaterials mit einem auf 40-37°C gekühlten, geschmolzenen Nährmedium so beimpft, dass isolierte Kolonien entstehen. Das Medium wird schnell abgekühlt und die Oberfläche mit einer Schicht einer sterilen Mischung aus Paraffin und Vaseline bedeckt. Sie können kapillare Pasteurpipetten verwenden, in denen die entsprechende Verdünnung des Agarmediums mit Beimpfung gesammelt wird. Das Ende der Kapillare ist verschlossen. Bei einer gut gewählten Verdünnung wachsen isolierte Kolonien im Reagenzglas oder in der Pipette. Um sie zu entfernen, wird das Reagenzglas (oder die Pipette) durch schnelles Rotieren über einer Brennerflamme oder schnelles Eintauchen in warmes Wasser leicht erhitzt, während das an der Wand anliegende Agar schmilzt und der Inhalt der Säule leicht in den sterilen Behälter rutscht Petrischale. Die Agarsäule wird mit einem sterilen Skalpell geschnitten und die Kolonien werden durch Auffangen mit einer sterilen Kapillarpipette oder Öse entfernt. Die extrahierten Kolonien werden in ein flüssiges Medium überführt, das die Entwicklung isolierter Mikroorganismen begünstigt. Wenn in einer Kapillare isolierte Kolonien gewonnen werden, wird diese nach gründlicher Desinfektion mit einer sterilen Pinzette aufgebrochen und die Abschnitte der Kapillare, die isolierte Kolonien enthalten, in eine sterile Umgebung überführt.

Bestimmung der Reinheit der isolierten Kultur

Die Reinheit der auf Schrägagar gescreenten Kolonien kann auf verschiedene Weise überprüft werden: visuell, mikroskopisch und durch Ausplattieren auf einer Reihe von Nährmedien. Bei der visuellen Inspektion ist das Wachstum von Mikroorganismen entlang des Streifens auf der Oberfläche des abgeschrägten Nährmediums sichtbar. Wenn das Wachstum entlang der Linie nicht gleichmäßig ist, gilt die Pflanze als kontaminiert. Eine solche Bekämpfung ist jedoch nur bei Kulturpflanzen möglich, die auf der Oberfläche fester Nährböden wachsen können. Daher muss die Reinheit der Kultur unter einem Mikroskop überwacht werden. Bereiten Sie dazu ein Präparat aus gefärbten Zellen vor und betrachten Sie es unter Eintauchen. Eine Reinkultur sollte morphologisch homogen sein und darf nur geringe Unterschiede in der Zellgröße aufweisen.

Die Bestimmung der systematischen Position von Bakterien umfasst die Untersuchung einer Reihe von Merkmalen: morphologische, kulturelle und physiologisch-biochemische.

Kulturelle Merkmale

Zu den kulturellen oder makromorphologischen Merkmalen zählen charakteristische Merkmale des Wachstums von Mikroorganismen auf festen und flüssigen Nährböden.

Wachstum auf festen Nährböden.

Auf der Oberfläche dichter Nährmedien können Mikroben in Form von Kolonien, Streifen oder einem durchgehenden Rasen wachsen. Eine Kolonie ist eine isolierte Ansammlung von Zellen desselben Typs, die in den meisten Fällen aus einer einzelnen Zelle hervorgeht. Je nachdem, wo sich die Zellen entwickelt haben, werden Oberflächen-, Tiefen- und Bodenkolonien unterschieden. Auf der Oberfläche des Mediums gewachsene Kolonien sind äußerst vielfältig. Bei der Beschreibung werden folgende Merkmale berücksichtigt:

Kolonieform- rund, amöbenförmig, unregelmäßig, rhizoid usw.;

Kolonieoberfläche- glatt, rau, gefurcht, gefaltet, faltig, radial gestreift, mit konzentrischen Kreisen;

Kolonieprofil- flach, konvex, kraterförmig, kegelförmig, konvex in der Mitte mit einer Kante am Rand, in der Mitte vertieft, mit einer Kante am Rand usw.;

Glanz und Transparenz- glänzend, matt, matt, pudrig, transparent;

Koloniefarbe- farblos (schmutzig weiße Kolonien werden als farblos eingestuft) oder pigmentiert - weiß, gelb, golden, orange, lila, rot, schwarz. Besonders hervorzuheben ist die Freisetzung von Pigmenten in den Untergrund;

Rand der Kolonie- glatt, wellig, gezackt, gesäumt, wurzelförmig usw.;

Koloniestruktur- homogen, fein- und grobkörnig, streifig (Rand und Struktur der Kolonie werden mit einer Lupe oder bei geringer Vergrößerung eines Mikroskops bestimmt);

Koloniekonsistenz- es wird durch Berühren der Kolonie mit einer Schlaufe bestimmt. Die Kolonie lässt sich leicht vom Agar entfernen, ist dicht, weich, wächst in den Agar hinein, ist schleimig (klebt an der Öse), zähflüssig, filmartig (vollständig entfernt) und zerbrechlich.

Tiefe Kolonien sind ziemlich eintönig. Meistens sehen sie aus wie abgeflachte Linsen, in der Projektion haben sie die Form von Ovalen mit spitzen Enden. Kolonien einiger weniger Bakterien ähneln Wattebündeln mit fadenförmigen Auswüchsen im Medium. Die Bildung tiefer Kolonien geht oft mit einem Aufbrechen des dichten Mediums einher, wenn Mikroben Gase produzieren. Bodenkolonien verschiedenster Mikroorganismen sehen aus wie dünne transparente Filme, die sich am Boden entlang ausbreiten.

Die Größe und einige andere Eigenschaften von Kolonien ändern sich mit dem Alter und hängen von der Zusammensetzung des Mediums ab. Bei der Beschreibung werden daher das Alter der Kultur, die Zusammensetzung des Mediums und die Kultivierungstemperatur angegeben.

Bei der Beschreibung des Wachstums eines Mikroorganismus durch Schlaganfall werden folgende Merkmale festgestellt: Das Wachstum ist spärlich, mäßig oder reichlich, kontinuierlich mit einer glatten oder gewellten Kante, deutlich sichtbar, ähnelt Ketten isolierter Kolonien, diffus, federartig, baumartig oder rhizoid . Charakterisieren Sie die optischen Eigenschaften von Plaque, seine Farbe, Oberfläche und Konsistenz.

Wachstum auf flüssigen Nährmedien.

Unterscheiden folgenden Formen Bakterienwachstum auf flüssigen Nährmedien:

Trübung des Mediums. Ein solches Wachstum ist charakteristisch für viele pathogene Mikroben, die zur Gruppe der fakultativen Anaerobier gehören.

Bodenwachstum. Gekennzeichnet durch die Bildung von Sedimenten am Boden des Reagenzglases. Es kann spärlich oder reichlich, krümelig, homogen, faserig oder in Form großer, lockerer Flocken vorliegen. Die Konsistenz des Sediments kann zähflüssig, schleimig, spröde oder pastös sein. Wenn die Kultur kein Pigment produziert, ändert sich die Farbe des Mediums nicht und das Sediment wird grauweiß oder gelblich. Das Bodenwachstum ist charakteristisch für Bakterien mit anaerober Atmung.

Parietales Wachstum Bakterien äußert sich darin, dass das Nährmedium im Reagenzglas transparent bleibt. Bakterien wachsen in Form großer loser Flocken oder kompakter Körner, die an der Innenfläche der Reagenzglaswände haften.

Oberflächliches Wachstum Bakterien zeichnen sich durch das Auftreten eines Films auf der Oberfläche des flüssigen Nährmediums aus. Der Film kann dünn, farblos, beim Schütteln oder Schütteln verschwindend, nass, zähflüssig, schleimig, dicht, trocken sein und bei Materialentnahme vollständig in Form einer runden Scheibe abgezogen werden. Das Wachstum von Mikroorganismen in einem flüssigen Nährmedium geht häufig mit dem Auftreten von Gas und Geruch einher.