Qëllimi i fazës së dytë të metodës bakteriologjike: marrja e një kulture të pastër të mikroorganizmave dhe akumulimi i saj. Për ta bërë këtë, kryeni:

· Studimi makroskopik i kolonive në dritën e transmetuar dhe të reflektuar (karakteristikat e madhësisë, formës, ngjyrës, transparencës, konsistencës, strukturës, konturit, sipërfaqes së kolonive).

· Ekzaminimi mikroskopik i kolonive të izoluara dhe më pas përgatitja dhe ekzaminimi i strisheve nga këto koloni.

· Mbjellja e kolonive karakteristike për lloj i caktuar, mbi mjediset e akumulimit të kulturës së pastër ose mjediset selektive dhe inkubimin në kushte optimale.

Karakteristikat kulturore të mikrobeve përcaktohen nga natyra e rritjes së tyre në mjediset ushqyese. Duke qenë konstante për çdo lloj mikrobi, ato janë një shenjë e rëndësishme diagnostike.

Kur izoloni një kulturë të pastër të një mikroorganizmi, duhet t'i kushtoni vëmendje modelit të rritjes së mikrobit, d.m.th. mbi karakteristikat kulturore si një nga karakteristikat që lejon identifikimin e gjinisë ose llojit të mikroorganizmit. Kur kultivohet një mikrob në mjedise të lëngshme, rritja e baktereve mund të shihet në formën e:

a) turbullira difuze;

b) Rritja e poshtme dhe e mureve në një mjedis transparent;

c) film sipërfaqësor;

d) "një copë leshi pambuku".

Në media gjysmë të lëngshme mund të vërehen:

a) rritja difuze rreth inokulimit (bakteret lëvizëse);

b) rritja gjatë rrjedhës së injektimit (bakteret e palëvizshme);

c) këputja e mediumit ose formimi i flluskave të gazit.

Në media të dendura vërehet si më poshtë:

a) rritja në koloni të veçanta;

b) rritje në lulëzim të vazhdueshëm.

Rritja e mikrobeve në një mjedis të ngurtë ushqyes. Për të studiuar vetitë e kolonive, mikrobet kultivohen në mjedise të forta ushqyese në enët Petri. Kur mbjellin material, ata përpiqen të marrin rritje të izoluar të kolonive.

Bazuar në natyrën e kolonive, dallohen llojet e mëposhtme:

· Lloji S (nga anglishtja smooth - smooth) - kolonitë karakterizohen nga një formë e rrumbullakët dhe konveks, sipërfaqe e lëmuar, konsistencë e lagësht;

· Kolonitë e tipit R (nga anglishtja e përafërt - e përafërt) karakterizohen nga një sipërfaqe e ashpër, skaje të parregullta dhe konsistencë të thatë. Ato formohen nga forma të lëmuara S si rezultat i mutacioneve. Kalimi i S-formave në R-forma vërehet gjatë disociimit. Fenomeni i disociimit në mikrobet patogjene vërehen nën ndikimin e antibiotikut dhe kimioterapisë, faktorët specifikë të imunitetit të formuar gjatë procesit infektiv, si dhe faktorët mjedisorë.

· Përveç këtyre dy llojeve kryesore të kolonive, ekziston një lloj M mukoz (nga latinishtja mucus - mucous), i karakterizuar nga një konsistencë mukoze viskoze. Formohet gjatë shpërbërjes së kulturave bakteriale.

Bakteret e secilës specie formojnë koloni me shenja të ndryshme. Karakteri i tyre studiohet me sy të lirë në dritën e transmetuar dhe të reflektuar, si dhe duke përdorur një xham zmadhues ose mikroskop me zmadhim të ulët. Në fillim të studimit, kthejeni pjesën e poshtme të filxhanit drejt jush dhe ekzaminoni kupat në dritën e transmetuar. Nëse ka koloni të ndryshme, secila prej tyre numërohet dhe përshkruhet veçmas. Protokolli shënon karakteristikat e mëposhtme.

1. Madhësia e kolonive përcaktohet nga diametri i tij (i madh - me një diametër 4-6 mm ose më shumë, i mesëm - 2-4 mm, i vogël - 1-2 mm dhe i saktë - më pak se 1 mm).

2. Forma e kolonive(Rrumbullak i rregullt, në formë amebe të çrregullt, në formë rozete, rizoid - në formë rrënjë, që të kujton rrënjët e ndërthurura të pemëve, etj.).

3. Shkalla e transparencës(e errët, e tejdukshme, transparente).

4. Struktura e kolonisë. Bazuar në natyrën e strukturës, dallohen llojet e mëposhtme të kolonive:

· hialine - i pangjyrë, transparent, pa një strukturë specifike të dukshme;

· kokrrizore, të cilat në varësi të madhësisë së kokrrave ndahen në të imta dhe të trashë;

· filamentoze ose fibroze, e karakterizuar nga prania e fijeve të gjata, të ndërthurura dendur në trashësinë e kolonisë. Kolonitë mund të jenë homogjene ose heterogjene. Struktura e të parës është e njëjtë në të gjitha pjesët, ndërsa në këtë të fundit pjesa qendrore ndryshon nga ajo periferike, ose sektorët individualë kanë një strukturë që është e ndryshme nga pjesa tjetër e masës.

5. Ngjyra e kolonisë përcaktohet nga pigmenti i prodhuar nga kultura mikrobike. Shumica dërrmuese e baktereve patogjene nuk prodhojnë pigment, si rezultat i të cilit kolonitë e tyre janë të pangjyrë ose me ngjyrë qumështi-turbull, të ngjashme me opalin. Në dritën e transmetuar, koloni të tilla janë pak a shumë transparente. Llojet e mikrobeve që formojnë pigment prodhojnë koloni me ngjyra të ndryshme: krem, të verdhë, ari-portokalli, blu, të kuqe, jargavan, të zezë, etj.

6. Karakteri sipërfaqësor(i ashpër, me shkëlqim, mat, i thatë, i lagësht, i lëmuar, i strijuar në mënyrë radiale ose koncentrale).

7. Natyra e konturit të skajit. Ka skaje të lëmuara në formën e një linje të përcaktuar qartë dhe të pabarabarta. Këto të fundit ndahen në:

· skaj i skallopuar, i përbërë nga dhëmbë të mëdhenj, pak të rrumbullakosur ose të rrafshuar me formë të rregullt;

· një skaj i valëzuar, i cili ndryshon disi nga ai i skallopuar në atë që dhëmbët e tij të mëdhenj nuk janë të përcaktuar qartë;

· skaj i gërryer ose i dhëmbëzuar, i përbërë nga dhëmbë të mprehtë të madhësive dhe formave të ndryshme;

· buzë me thekë me fibra delikate. Në disa raste, nuk ka asnjë vijë të përcaktuar qartë që kufizon koloninë nga sipërfaqja e mediumit. Ky skaj i kolonisë quhet difuz.

8. Lehtësim karakterizohet nga ngritja e tij mbi sipërfaqen e mediumit ushqyes dhe kontura e formës në një seksion vertikal. Ka relieve që janë konveks, të zhytur, të rrafshët, në trajtë koni, në formë kupole, të sheshta me qendër në formë koni, me buzë të trasuara në formë rul etj.

9. Konsistenca e kolonisë, i cili përcakton gjendjen fizike të tij, ekzaminohet duke prekur ose marrë një pjesë të materialit prej tij me një lak bakteriologjik me një lak bakterial. Në varësi të konsistencës së kolonisë, ekzistojnë:

në formë paste, që hiqet lehtë dhe gërryhet mbi sipërfaqen e lëndës ushqyese si gjalpë;

viskoze ose rrëshqitëse, që ngjitet dhe zvarritet në një lak

· fibroze ose lëkurë, e dendur, e hequr nga sipërfaqja e lëndës ushqyese në formën e një filmi elastik që korrespondon me madhësinë dhe formën e kolonisë;

· sythe të brishta, të thata, që shkërmoqet kur preken.

Kolonitë e disa llojeve të baktereve rriten në trashësinë e mediumit ushqyes, i cili përcaktohet gjithashtu nga një lak bakteriologjik.

10. Erë- një shenjë më pak e rëndësishme e kolonive, pasi shoqatat që ngjall janë subjektive. Shumë lloje bakteresh, kur rriten në mjedise ushqyese, lëshojnë substanca aromatike specifike. Në veçanti, kulturat e Pseudomonas aeruginosa kanë erën e karamelit, kulturat e Listeria - hirrë, Nocardia - tokë e sapo gërmuar, Proteus - një erë e kalbur.

III. Planifikoni punë praktike

1. Studioni vetitë kulturore të kolonive të rritura në MPA (rishikim i kulturave të bëra në mësimin e mëparshëm)

2. Hiqeni koloninë e izoluar (kultura e pastër) (në vija) në mjedisin e akumulimit (MPA e pjerrët)

3. Studioni dhe skiconi modelet e rritjes së baktereve të ndryshme në mjedise të thjeshta dhe komplekse ushqyese

4. Plotësoni tabelën “Klasifikimi i mikroorganizmave sipas llojit të frymëmarrjes”

5. Zgjidh problemet e situatës

Një fazë e rëndësishme e hulumtimit bakteriologjik është kultura. Në varësi të qëllimit të studimit, natyra e material farë dhe mediat përdorin metoda të ndryshme mbjelljeje. Të gjitha përfshijnë një qëllim të detyrueshëm: mbrojtjen e qenit nga mikrobet e huaja. Prandaj, duhet të punoni shpejt, por pa lëvizje të papritura që rrisin dridhjet e ajrit. Nuk mund të flasësh gjatë mbjelljes. Mbjellja bëhet më së miri në një kuti (kur punoni me material infektiv, duhet të ndiqni rregullat e sigurisë personale).

Fazat e izolimit të kulturës së pastër:

Dita 1 - marrja e kolonive të izoluara. Një sasi e materialit testues aplikohet në sipërfaqen e agarit në një enë Petri duke përdorur një lak, pipetë ose shufër qelqi. Shpatula përdoret për të fërkuar materialin në sipërfaqen e mediumit; Pa djegur ose kthyer shpatullën, mbillni në filxhanin e dytë dhe më pas në filxhanin e tretë. Me një mbjellje të tillë, kupa e parë përmban shumë materiale dhe, në përputhje me rrethanat, shumë mikrobe, kupa e dytë përmban më pak, dhe kupa e tretë përmban edhe më pak.

Kolonitë e izoluara mund të merren me mbjellje me unazë. Për ta bërë këtë, materiali në studim emulsifikohet në supë ose në zgjidhje izotonike të klorurit të natriumit.

Dita 2 - studioni rritjen e mikrobeve në pjata. Në kupën e parë zakonisht ka rritje të vazhdueshme - nuk do të jetë e mundur të izoloni një koloni të izoluar. Kolonitë e izoluara rriten në sipërfaqen e agarit në pllakat 2 dhe 3. Ato studiohen me sy të lirë, me xham zmadhues, me zmadhim të ulët të mikroskopit dhe ndonjëherë në mikroskop stereoskopik. Kolonia e dëshiruar shënohet nga fundi i enës dhe ri-inokulohet në një pjerrësi agar. Të lashtat vendosen në një termostat. (Vetëm kolonitë e izoluara mund të riprodhohen.)

Dita 3 - studioni modelin e rritjes në pjerrësi të agarit. Ata bëjnë një njollë, e njollosin dhe, duke u siguruar që kultura të jetë e pastër, fillojnë ta studiojnë atë. Këtu përfundon izolimi i kulturës së pastër. Një kulturë e izoluar nga një burim specifik dhe e studiuar quhet "shtjellim".

Kur izolohet një kulturë e pastër nga gjaku (hemokultura), ajo fillimisht "rritet" në një mjedis të lëngshëm: 10-15 ml gjak të marrë në mënyrë sterile inokulohet në 100-150 ml medium të lëngshëm. Kjo bëhet sepse zakonisht ka pak mikrobe në gjak. Raporti i gjakut të inokuluar me lëndën ushqyese 1:10 nuk është i rastësishëm - kështu arrihet hollimi i gjakut (gjaku i paholluar ka një efekt të dëmshëm mbi mikroorganizmat). Balonat e inokuluara vendosen në një termostat. Pas një dite (ndonjëherë pas një kohe më të gjatë, në varësi të kulturës që izolohet), përmbajtja e balonave inokulohet në pllaka për të marrë koloni të izoluara. Nëse është e nevojshme, përsëritni mbjelljen në intervale prej 2-3 ditësh.

Kur izolohet një kulturë e pastër nga urina, lavazhi i stomakut dhe lëngjet e tjera, ato fillimisht centrifugohen në kushte aseptike dhe sedimenti inokulohet. Izolimi i mëtejshëm i kulturës së pastër kryhet në mënyrën e zakonshme.

Mediat zgjedhore përdoren gjerësisht për të izoluar kulturat e pastra. Përdoren një sërë metodash veçoritë biologjike mikrobi i lëshuar. Për shembull, kur izolohen bakteret që formojnë spore, të korrat nxehen për 10 minuta në 80°C, duke vrarë kështu format vegjetative. Gjatë izolimit të agjentit shkaktar të tuberkulozit, i cili është rezistent ndaj acideve dhe alkaleve, me ndihmën e këtyre substancave, materiali i farës çlirohet nga shoqëruesit! florës. Për të izoluar pneumokokun dhe bacilin e murtajës, materiali në studim injektohet te minjtë e bardhë - në trupin e tyre, i cili është shumë i ndjeshëm ndaj këtyre patogjenëve, këta mikro-] do të shumohen më shpejt se të tjerët.

Në punën kërkimore, veçanërisht në gjen-; Në kërkimin shkencor, është e nevojshme të merren kultura në një kohë nga një qelizë. Një kulturë e tillë quhet "klon"] Për ta marrë atë, përdoret më shpesh një mikromanipulator - një pajisje e pajisur me instrumente (gjilpëra, pipeta) me madhësi mikroskopike. Duke përdorur një mbajtës nën kontrollin e një mikroskopi, ato futen në përgatitjen "B qindta pika", qeliza e dëshiruar (një) hiqet dhe transferohet në një medium ushqyes.

Studimi i kulturave të përzgjedhura

Studimi i morfologjisë, lëvizshmërisë, vetive tintoriale, modeleve të rritjes në media (vetitë kulturore);! aktiviteti enzimatik dhe një sërë veçorish të tjera ju! Mikrobi i ndarë na lejon të vendosim taksonomik | ndonjë pozicion, d.m.th të klasifikojë mikroorganizmin: op| ndani gjininë, llojin, llojin, nëntipin, varietetin e tij. Ky quhet "identifikim". Identifikimi i mikroorganizmave| mov është shumë i rëndësishëm në diagnostikimin e infeksioneve, burimet dhe rrugët e transmetimit të tij janë përcaktuar në një sërë studimesh të tjera shkencore.

FITIMIN E KULTURAVE TË PASTËRA.

Një kulturë e pastër e mikrobeve është një popullatë mikroorganizmash të një specie të marrë nga një koloni mikrobike e izoluar. Një koloni mikrobike i referohet pasardhësve të baktereve që rezultojnë nga riprodhimi i një qelize mikrobike.

Izolimi i një kulture të pastër të mikrobeve është një fazë e detyrueshme e çdo studimi bakteriologjik. Kultura e pastër është e nevojshme për studimin e vetive morfologjike, kulturore, biokimike dhe antigjenike, tërësia e të cilave përcakton llojin e mikroorganizmit në studim.

Janë bërë shumë propozime për izolimin e kulturave të pastra të mikrobeve nga materialet që përmbajnë mikroflora të bollshme të përziera. metoda të ndryshme. Më i përhapuri metoda e ndarjes mekanike të mikroorganizmave, të vendosura në materialin në studim, për të përftuar koloni të izoluara në sipërfaqe ose në thellësi të mjedisit ushqyes. Mjetet ushqyese zgjedhore përdoren gjerësisht për të stimuluar zhvillimin e atyre mikroorganizmave, kultura e pastër e të cilëve supozohet të jetë e izoluar. Disa lloje të mikrobeve janë shumë të ndjeshme ndaj disa faktorëve mjedisorë. Rezistenca individuale e mikrobeve ndaj një ose një faktori tjetër u përdor për të zhvilluar metoda për izolimin e kulturave të pastra duke vrarë mikroflora shoqëruese. Kjo metodë përdoret për të izoluar format spore të mikrobeve që janë rezistente ndaj temperaturave të larta.

Njihen relativisht pak metoda për izolimin e baktereve si kultura të pastra. Kjo më së shpeshti bëhet duke izoluar qelizat individuale në një medium ushqyes të ngurtë duke përdorur metodën e shtresëzimit të brezit.

Kolonitë identike zakonisht rriten nga një kulturë e pastër dhe mikroskopi zbulon qeliza të ngjashme, veçanërisht në madhësi dhe ngjyrosje Gram. Sidoqoftë, përjashtime janë të mundshme, për shembull, kolonitë që rriten nga një kulturë e pastër mund të jenë të lëmuara (S) ose të përafërta (R). Përveç kësaj, në kulturat e pastra të mikroorganizmave të ndryshëm, mund të shfaqen qeliza kokoide, kiste dhe spore. Së fundi, disa mikroorganizma shfaqin ndryshueshmëri gram.

Mbjellja me një goditje. Ka shumë metoda për shtrimin e pllakave që përmbajnë media të ngurta ("pllaka goditëse"), por vetëm disa prej tyre pothuajse gjithmonë prodhojnë koloni të izoluara mirë, edhe në mungesë të aftësive nga ana e eksperimentuesit. Përndryshe, tretësirat e holluara të kulturave të përziera mund të derdhen mbi sipërfaqen e mediave të ngurta në pllaka.

Kur punoni me anaerobe, "pjatat e çelura" ose enët me kulturë të lëngshme të futura në to në një atmosferë ajri më pas inkubohen në një anaerostat. Anaerobet kërkojnë mediume të sapopërgatitura dhe vija duhet të bëhet brenda 4 orëve të para të autoklavimit për të shmangur akumulimin e oksigjenit të tretur.

1. Për shënimin në anën e pasme Enët Petri me laps vizatojnë shkronjën T, duke e ndarë pjesën e poshtme në 3 sektorë.

2. Në sipërfaqen e agarit në sektorin 1, duke përdorur një lak zigzag-u, aplikohen vija. Laku sterilizohet në flakë dhe lihet të ftohet (15 s).

3. Vizatoni një lak përgjatë sipërfaqes së mediumit në sektorin 1 dhe më pas aplikoni menjëherë goditje zigzag në sipërfaqen e mediumit në sektorin 2. Nxeheni lakin në flakë dhe lëreni të ftohet.

4. Vizatoni një lak përgjatë sipërfaqes së mediumit në sektorin 2 dhe më pas aplikoni goditje zigzag me të në sipërfaqen e mediumit në sektorin 3.

5. Inkuboni enët me kokë poshtë në mënyrë që uji i kondensimit nga kapaku të mos bjerë mbi sipërfaqen e agarit. Në sektorin 1 rritet një numër i madh i kolonive, ndërsa në sektorët 2 dhe 3 shfaqen koloni individuale të izoluara mirë.

Marrja e një kulture të pastër duke e shoshitur në thellësi të mediumit (sipas Koch). Tre epruveta që përmbajnë 15 ml agar peptone mishi secila vendosen në një banjë uji për të shkrirë agarin. Mjeti i shkrirë ftohet në temperaturën 43-45°C. Një lak bakterial i materialit testues futet në provëz. Për ta përzier më mirë materialin me mediumin, rrotullojeni epruvetën e inokuluar disa herë, duke e mbajtur midis pëllëmbëve. Pas kësaj, duke përdorur një lak të kalcinuar dhe të ftohur, përmbajtja e epruvetës së parë transferohet në të dytin dhe në të njëjtën mënyrë nga e dyta në të tretën. Hollimet e përgatitura të mikrobeve derdhen nga epruvetat në enë sterile Petri, të shënuara me numra që korrespondojnë me numrat e provëzave. Pasi mediumi me materialin e provës të jetë bërë xhel, kupat vendosen në një termostat. Numri i kolonive në pllakat e mjedisit të kulturës zvogëlohet ndërsa materiali hollohet.

Izolimi i kulturës së pastër duke përdorur metodën Drigalski. Mjeti ushqyes i shkrirë derdhet në tre enë Petri. Mediumi i ngrirë duhet të thahet, pasi sipërfaqja e tij e lagësht nxit formimin e rritjes së bashkimit. Një pikë e materialit testues shtohet në filxhanin e parë dhe fërkohet në sipërfaqen e lëndës ushqyese me një shpatull sterile. Më pas, pa djegur nëpër shpatull ose pa mbledhur material të ri, spatula transferohet në gotën e dytë dhe të tretë, duke fërkuar materialin e mbetur mbi të në sipërfaqen e mediave ushqyese. Metoda e sitës sipërfaqësore e propozuar nga Drigalsky është metoda më e përdorur për marrjen e një kulture të pastër mikrobesh. Në vend të një shpatulle, mund të përdorni një lak. Materiali në mediumin ushqyes shpërndahet në lëvizje paralele në të gjithë filxhanin në një drejtim. Më pas, duke e kthyer filxhanin 180°, bëhen goditje në drejtim pingul me goditjet e para. Me këtë metodë të mbjelljes, materiali në lak konsumohet gradualisht, dhe kolonitë e izoluara të mikrobeve rriten përgjatë vijave të rrjetës të tërhequra në fund të mbjelljes.

Njihen relativisht pak metoda për izolimin e baktereve si kultura të pastra. Kjo më së shpeshti bëhet duke izoluar qelizat individuale në një mjedis të ngurtë të kulturës, duke përdorur metodën e shtrimit me brez, ose duke derdhur një sasi të vogël të kulturës së lëngshme në pllaka ( Metoda e hollimit kufizues). Sidoqoftë, marrja e një kolonie të veçantë nuk garanton gjithmonë pastërtinë e kulturës, pasi kolonitë mund të rriten jo vetëm nga qelizat individuale, por edhe nga grupimet e tyre. Nëse mikroorganizmat formojnë mukus, atëherë format e huaja shpesh i bashkëngjiten asaj. Për pastrim, preferohet të përdoret një medium jo selektiv (NSM), pasi mikroorganizmat kontaminues rriten më mirë në të dhe zbulohen më lehtë.

Marrja e kolonive të izoluara në një mjedis të ngurtë ushqyes arrihet ose duke shoshitur një suspension të mikroorganizmave me një shpatull ( Metoda Koch), ose duke përdorur një lak bakteriologjik ( Metoda e goditjes së lodhjes). Si rezultat i ndarjes mekanike të qelizave të mikroorganizmave, secila prej tyre mund të krijojë një koloni të izoluar të një lloji mikrobi.

Sitë me një shpatull (metoda Koch) prodhuar në sekuencën e mëposhtme:

1) një pikë e një kulture pasurimi aplikohet në sipërfaqen e mediumit ushqyes në enën nr. 1 me një pipetë sterile dhe shpërndahet me një shpatull sterile;

2) Nxirreni spatulën, mbylleni shpejt filxhanin dhe kaloni shpatullën në filxhanin nr. 2 pa e sterilizuar. Simuloni shpërndarjen e kulturës në të gjithë sipërfaqen e mediumit duke prekur sipërfaqen e tij me të njëjtën anë të shpatullës që është përdorur më parë për shpërndarjen e kampionit;

3) saktësisht të njëjtat veprime kryhen në kupën nr. 3, pas së cilës spatula sterilizohet;

4) enët me fara vendosen në një termostat dhe inkubohen në temperaturën optimale.

Pas një kohe të caktuar, kupat hiqen nga termostati dhe studiohet rritja e mikroorganizmave. Zakonisht, rritja e vazhdueshme e baktereve vërehet në filxhanin nr. 1, dhe kolonitë vërehen në kupat e mëvonshme.

Sitë me lak (metoda e brezit të kullimit) përfshin mbjelljen e një lak bakteriologjik nga një kulturë pasurimi në sipërfaqen e një mjedisi agar në enët Petri. Në fazën e parë, një seri goditjesh paralele aplikohen në mjedisin e agarit duke përdorur një lak me kulturën (Figura 4.2, A). Laku sterilizohet, ftohet në pjesën e painokuluar të mediumit të agarit dhe bëhen një sërë goditjesh në drejtim pingul me të parët (Figura 4.2, B). Pastaj laku sterilizohet përsëri, ftohet dhe goditjet aplikohen në drejtim NË(Figura 4.2), dhe pas sterilizimit të radhës - në drejtim G(Figura 4.2). Kupat vendosen në një termostat dhe rezultatet merren parasysh pas një kohe të caktuar. Zakonisht në goditje A Dhe B rritet një numër i madh i kolonive (nganjëherë rritje e vazhdueshme), ndërsa në goditje NË Dhe G formohen koloni të izoluara.

Figura 4.2 - Skema e sitës së brezit të baktereve për të marrë koloni të izoluara

Hollimet serike në media të ngurta- metoda më e thjeshtë e mbjelljes së pllakave, e cila konsiston në faktin se pas inokulimit të kampionit në një epruvetë me agar steril të shkrirë dhe të ftohur, mediumi përzihet, derdhet në një enë Petri dhe lihet të ngurtësohet. Për të marrë koloni të izoluara mirë, përgatitni një seri hollimesh të njëpasnjëshme dhjetëfish dhe shtoni 1 ml mostra direkt në filxhan, shtoni 15-20 ml mjedis agar të shkrirë dhe përzieni duke tundur filxhanin. Ndonjëherë kolonitë individuale përfundojnë të zhytura në agar dhe mund të hiqen vetëm mekanikisht. Është gjithashtu e keqe që bakteret kalojnë pak kohë në një mjedis në temperaturën e agarit të shkrirë.

Izolimi i kulturës së pastër

Metoda kryesore për izolimin e kulturave të pastra të baktereve është metoda e propozuar nga R. Koch, parimi i së cilës është të merret një kulturë bakteresh nga kolonitë e izoluara. Kur izolohet një kulturë e pastër aerobe, kultura e pasurimit ose materiali që studiohet mbillet në një mjedis të ngurtë ushqyes. Procedura e funksionimit është si më poshtë. Mjeti ushqyes i shkrirë derdhet në enë sterile Petri. Pasi mediumi të jetë ngurtësuar, një pikë e materialit testues aplikohet në sipërfaqen e tij dhe, duke përdorur një shpatull sterile Drigalsky, pika shpërndahet së pari përgjatë njërës anë të sipërfaqes së mediumit ushqyes në një enë Petri, pastaj përgjatë tjetrës. Duke përdorur të njëjtën shpatull, fshijeni sipërfaqen e mediumit të dendur në gotat e 2-të, 3-të dhe 4-të. Enët inkubohen në temperaturën optimale për mikrobet (më shpesh 37°C) deri në 2 ditë. Në mënyrë tipike, rritja e vazhdueshme e mikrobeve vërehet në dy enët e para pas inkubimit, ndërsa kolonitë e izoluara vërehen në enët pasuese.

Kultura e pasurimit mund të shpërndahet duke përdorur metodën e brezit të hollimit. Në këtë rast, kultura e pasurimit ose hollimi i saj zgjidhet me një lak dhe vijat tërhiqen përmes një mediumi të dendur ushqyes në një pjatë Petri në një renditje të caktuar. Para çdo goditjeje të re, laku sterilizohet. Enët termostohen për 1-7 ditë, në varësi të shkallës së rritjes së mikroorganizmit. Kolonitë e izoluara të rritura kontrollohen duke përdorur metodën e brezit në epruveta në sipërfaqen e një mjedisi të pjerrët ose në një mjedis të lëngshëm.

Kolonitë e izoluara të anaerobeve dhe anaerobeve fakultative fitohen me inokulim të thellë. Për këtë qëllim, 0,5-1,0 ml hollim të materialit testues inokulohet në epruveta me një lëndë ushqyese të shkrirë të ftohur në 40-37°C në mënyrë të tillë që të përftohen koloni të izoluara. Mediumi ftohet shpejt dhe sipërfaqja mbulohet me një shtresë të përzierjes sterile të parafinës dhe vazelinës. Mund të përdorni pipeta kapilare Pasteur, në të cilat mblidhet hollimi i duhur i mediumit të agarit me inokulim. Fundi i kapilarit është i mbyllur. Me një hollim të zgjedhur mirë, kolonitë e izoluara rriten në një epruvetë ose pipetë. Për t'i hequr ato, epruveta (ose pipeta) nxehet pak duke e rrotulluar shpejt mbi një flakë djegëse ose duke e zhytur shpejt në ujë të ngrohtë, ndërsa agari ngjitur me murin shkrihet dhe përmbajtja e kolonës rrëshqet lehtësisht në një steril. Pjatë Petri. Kolona e agarit pritet me një bisturi steril dhe kolonitë hiqen duke i kapur me një pipetë ose lak kapilar steril. Kolonitë e nxjerra transferohen në një mjedis të lëngshëm të favorshëm për zhvillimin e mikroorganizmave të izoluar. Nëse kolonitë e izoluara merren në një kapilar, atëherë pas dezinfektimit të plotë ai thyhet me piskatore sterile dhe seksionet e kapilarit që përmbajnë koloni të izoluara transferohen në një mjedis steril.

Përcaktimi i pastërtisë së kulturës së izoluar

Pastërtia e kolonive të ekzaminuara në agar të pjerrët mund të kontrollohet në disa mënyra: vizualisht, mikroskopikisht dhe duke vendosur në një numër të lëndëve ushqyese. Gjatë inspektimit vizual, rritja e mikroorganizmave është e dukshme përgjatë brezit në sipërfaqen e mediumit ushqyes të pjerrët. Nëse rritja përgjatë vijës nuk është uniforme, atëherë kultura konsiderohet e kontaminuar. Megjithatë, një kontroll i tillë është i mundur vetëm për kulturat që mund të rriten në sipërfaqen e mediave të ngurta ushqyese. Prandaj, pastërtia e kulturës duhet të monitorohet nën një mikroskop. Për ta bërë këtë, përgatitni një përgatitje të qelizave të njollosura dhe shikoni atë nën zhytje. Një kulturë e pastër duhet të jetë morfologjikisht homogjene dhe mund të ketë vetëm ndryshime të vogla në madhësinë e qelizave.

Përcaktimi i pozicionit sistematik të baktereve përfshin studimin e një sërë karakteristikash: morfologjike, kulturore dhe fiziologjike-biokimike.

Karakteristikat kulturore

Karakteristikat kulturore ose makromorfologjike përfshijnë tipare karakteristike të rritjes së mikroorganizmave në mjedise ushqyese të ngurta dhe të lëngshme.

Rritja në media të ngurta ushqyese.

Në sipërfaqen e mediave të dendura ushqyese, mikrobet mund të rriten në formën e kolonive, vijave ose një lëndinë të vazhdueshme. Një koloni është një koleksion i izoluar i qelizave të të njëjtit lloj, që rritet në shumicën e rasteve nga një qelizë e vetme. Në varësi të vendit ku janë zhvilluar qelizat, dallohen kolonitë sipërfaqësore, të thella dhe të poshtme. Kolonitë e rritura në sipërfaqen e mediumit janë shumë të ndryshme. Gjatë përshkrimit të tyre, merren parasysh karakteristikat e mëposhtme:

formë kolonie- të rrumbullakëta, në formë amebe, të çrregullta, rizoid etj.;

sipërfaqja e kolonisë- i lëmuar, i përafërt, me brazdë, i palosur, i rrudhosur, i strijuar me rreze, me rrathë koncentrikë;

profili i kolonisë- i rrafshët, konveks, në trajtë krateri, në formë koni, konveks në qendër me kreshtë buzë buzës, i zhytur në qendër, me kreshtë buzë buzës etj.;

shkëlqim dhe transparencë- me shkëlqim, mat, i shurdhër, pluhur, transparent;

ngjyra e kolonisë- të pangjyrë (kolonitë e bardha të pista klasifikohen si të pangjyrë) ose të pigmentuara - e bardhë, e verdhë, e artë, portokalli, jargavan, e kuqe, e zezë. Veçanërisht i rëndësishëm është lëshimi i pigmentit në substrat;

skaji i kolonisë- të lëmuara, të valëzuara, të dhëmbëzuara, me thekë, në trajtë rrënjësh etj.;

struktura e kolonisë- homogjene, me kokërr të imët dhe të trashë, me vija (skaji dhe struktura e kolonisë përcaktohen duke përdorur një xham zmadhues ose me zmadhim të ulët të një mikroskopi);

konsistenca e kolonisë- përcaktohet duke prekur koloninë me një lak. Kolonia mund të hiqet lehtësisht nga agari, të jetë e dendur, e butë, që rritet në agar, mukoze (ngjitet në lak), viskoze, filmike (hequr tërësisht), e brishtë.

Kolonitë e thella janë mjaft monotone. Më shpesh ato duken si thjerrëza të rrafshuara, në projeksion kanë formën e vezave me skajet e theksuara. Kolonitë e disa baktereve ngjajnë me tufa leshi pambuku me dalje filamentoze në mjedis. Formimi i kolonive të thella shoqërohet shpesh me këputje të mediumit të dendur nëse mikrobet prodhojnë gazra. Kolonitë e poshtme të një shumëllojshmërie të gjerë mikroorganizmash duken si filma të hollë transparentë që përhapen përgjatë pjesës së poshtme.

Madhësia dhe disa karakteristika të tjera të kolonive ndryshojnë me moshën dhe varen nga përbërja e mjedisit, prandaj, kur përshkruhen ato, tregohet mosha e kulturës, përbërja e mjedisit dhe temperatura e kultivimit.

Kur përshkruhet rritja e një mikroorganizmi me goditje, vihen re karakteristikat e mëposhtme: rritja është e pakët, e moderuar ose e bollshme, e vazhdueshme me buzë të lëmuara ose të valëzuara, qartë e dukshme, e ngjashme me zinxhirët e kolonive të izoluara, difuze, me pupla, si pemë ose rizoid. . Karakterizoni vetitë optike të pllakës, ngjyrën, sipërfaqen dhe konsistencën e saj.

Rritja në media të lëngshme ushqyese.

Të dallojë format e mëposhtme Rritja bakteriale në media të lëngshme ushqyese:

Vranësira e mediumit. Një rritje e tillë është karakteristike për shumë mikrobe patogjene që i përkasin grupit të anaerobeve fakultative.

Rritja e poshtme. Karakterizohet nga formimi i sedimentit në fund të epruvetës. Mund të jetë i pakët ose i bollshëm, i ngjashëm me thërrime, homogjene, fibroze ose në formën e thekoneve të mëdha të lirshme. Konsistenca e sedimentit mund të jetë viskoze, e rrëshqitshme, e brishtë ose pastruese. Nëse kultura nuk prodhon pigment, atëherë ngjyra e mediumit nuk ndryshon dhe sedimenti bëhet gri në të bardhë ose të verdhë. Rritja e poshtme është karakteristikë e baktereve me frymëmarrje anaerobe.

Rritja parietale bakteret shprehet në faktin se lënda ushqyese në epruvetë mbetet transparente. Bakteret rriten në formën e thekoneve të mëdha të lirshme ose kokrrave kompakte të ngjitura në sipërfaqen e brendshme të mureve të epruvetës.

Rritje sipërfaqësore bakteret karakterizohen nga shfaqja e një filmi në sipërfaqen e mediumit të lëngshëm ushqyes. Filmi mund të jetë i hollë, pa ngjyrë, zhduket kur tundet ose tundet, i lagësht, viskoz, i rrëshqitshëm, i dendur, i thatë dhe kur merret materiali prej tij, mund të hiqet tërësisht në formën e një disku të rrumbullakët. Shpesh rritja e mikroorganizmave në një mjedis të lëngshëm ushqyes shoqërohet me shfaqjen e gazit dhe erës.