Namen druge stopnje bakteriološke metode: pridobivanje čiste kulture mikroorganizmov in njeno kopičenje. Če želite to narediti, izvedite:

· Makroskopska študija kolonij v prepuščeni in odbiti svetlobi (značilnosti velikosti, oblike, barve, prosojnosti, konsistence, strukture, konture, površine kolonij).

· Mikroskopski pregled izoliranih kolonij in nato priprava in pregled brisov iz teh kolonij.

· Sejanje kolonij, značilnih za določene vrste, na gojiščih za kopičenje čiste kulture ali selektivnih gojiščih in inkubacijo pod optimalnimi pogoji.

Kulturne značilnosti mikrobov so določene z naravo njihove rasti na hranilnih medijih. Ker so konstantni za vsako vrsto mikroba, so pomemben diagnostični znak.

Pri izolaciji čiste kulture mikroorganizma bodite pozorni na vzorec rasti mikroba, tj. o kulturnih značilnostih kot eni od značilnosti, ki omogoča identifikacijo rodu ali vrste mikroorganizma. Pri gojenju mikrobov v tekočem mediju je rast bakterij vidna v obliki:

a) razpršena motnost;

b) rast dna in stene v prozornem mediju;

c) površinski film;

d) "kepa vate."

V poltekočih medijih lahko opazimo:

a) razpršena rast okoli cepiva (gibljive bakterije);

b) rast vzdolž poteka vboda (nepremične bakterije);

c) pretrganje medija ali nastanek plinskih mehurčkov.

Na gostih medijih opazimo naslednje:

a) rast v ločenih kolonijah;

b) rast v neprekinjenem cvetenju.

Rast mikrobov na trdnem hranilnem mediju. Za preučevanje lastnosti kolonij se mikrobi gojijo na trdnih hranilnih medijih v petrijevkah. Pri setvi materiala poskušajo pridobiti izolirano rast kolonij.

Glede na naravo kolonij ločimo naslednje vrste:

· S-tip (iz angleščine gladko - gladko) - za kolonije je značilna okrogla in konveksna oblika, gladka površina, vlažna konsistenca;

· Za kolonije tipa R (iz angleščine rough – hrapav) je značilna hrapava površina, nepravilni robovi in ​​suha konsistenca. Nastanejo iz gladkih S-oblik kot posledica mutacij. Med disociacijo opazimo prehod S-oblik v R-oblike. Pojav disociacije v patogeni mikrobi opaženi pod vplivom antibiotikov in kemoterapije, specifičnih imunskih dejavnikov, ki nastanejo med infekcijskim procesom, pa tudi okoljskih dejavnikov.

· Poleg teh dveh glavnih vrst kolonij obstaja sluzni M-tip (iz latinskega mucus - sluz), za katerega je značilna viskozna sluzasta konsistenca. Nastane med disociacijo bakterijskih kultur.

Bakterije vsake vrste tvorijo kolonije z razna znamenja. Njihov značaj preučujemo s prostim očesom v prepuščeni in odbiti svetlobi, pa tudi z uporabo povečevalnega stekla ali mikroskopa z majhno povečavo. Na začetku študije obrnite dno skodelice proti sebi in preglejte skodelice v prepustni svetlobi. Če gre za različne kolonije, jih vsako posebej oštevilčimo in opišemo. Protokol upošteva naslednje značilnosti.

1. Velikost kolonij določen s premerom (veliki - s premerom 4-6 mm ali več, srednji - 2-4 mm, majhni - 1-2 mm in pikčasti - manj kot 1 mm).

2. Oblika kolonij(pravilno okrogle, nepravilne amebaste, rozetaste, rizoidno - korenaste oblike, ki spominjajo na prepletene drevesne korenine itd.).

3. Stopnja preglednosti(neprozoren, prosojen, prozoren).

4. Struktura kolonije. Glede na naravo strukture ločimo naslednje vrste kolonij:

· hialin – brezbarven, prozoren, brez specifične vidne strukture;

· zrnate, ki jih glede na velikost zrn delimo na drobno- in debelozrnate;

· nitasta ali vlaknasta, za katero je značilna prisotnost dolgih, gosto prepletenih niti v debelini kolonije. Kolonije so lahko homogene ali heterogene. Zgradba prvega je v vseh delih enaka, pri drugem pa se osrednji del razlikuje od obrobnega ali pa imajo posamezni sektorji strukturo, ki se razlikuje od preostale mase.

5. Barva kolonije določa pigment, ki ga proizvaja mikrobna kultura. Velika večina patogenih bakterij ne proizvaja pigmenta, zaradi česar so njihove kolonije brezbarvne ali mlečno motne barve, podobne opalu. V prepustni svetlobi so takšne kolonije bolj ali manj prozorne. Vrste mikrobov, ki tvorijo pigment, proizvajajo kolonije različnih barv: kremne, rumene, zlato-oranžne, modre, rdeče, lila, črne itd.

6. Površinski značaj(hrapavo, sijoče, mat, suho, mokro, gladko, radialno ali koncentrično progasto).

7. Narava konture roba. Obstajajo gladki robovi v obliki jasno definirane črte in neenakomerni. Slednji se delijo na:

· nazobčan rob, sestavljen iz velikih, rahlo zaobljenih ali sploščenih zob pravilne oblike;

· valovit rob, ki se od nazobčanega nekoliko razlikuje po tem, da njegovi veliki zobci niso jasno izraženi;

· razjeden ali nazobčan rob, sestavljen iz ostrih zob različnih velikosti in oblik;

· obrobljen rob z nežnimi vlakni. V nekaterih primerih ni jasno definirane črte, ki ločuje kolonijo od površine medija. Ta rob kolonije se imenuje difuzen.

8. Olajšanje značilen po dvigu nad površino hranilnega medija in obrisu oblike v navpičnem prerezu. Obstajajo reliefi, ki so izbočeni, vdolbini, ravni, stožčasti, kupolasti, ravni s stožčastim središčem, z odebeljenimi robovi v obliki valjev itd.

9. Konzistenca kolonije, ki določa njegovo fizično stanje, pregledamo tako, da se z bakteriološko zanko z bakterijsko zanko dotaknemo ali vzamemo del materiala iz njega. Glede na konsistenco kolonije obstajajo:

v obliki paste, ki se zlahka odstrani in razjeda po površini hranilnega medija maslo;

viskozen ali sluzast, lepljiv in vlečen v zanki

· vlaknasta ali usnjata, gosta, odstranjena s površine hranilnega medija v obliki elastičnega filma, ki ustreza velikosti in obliki kolonije;

· krhke, suhe zanke, ki se ob dotiku drobijo.

Kolonije nekaterih vrst bakterij se vraščajo v debelino hranilnega medija, kar prav tako določa bakteriološka zanka.

10. Vonj- manj pomemben znak kolonij, saj so asociacije, ki jih povzroča, subjektivne. Mnoge vrste bakterij pri rasti na hranilnih medijih sproščajo specifične aromatične snovi. Zlasti kulture Pseudomonas aeruginosa imajo vonj po karameli, kulture Listeria - sirotka, Nocardia - sveže izkopana zemlja, Proteus - gnilen vonj.

III. Načrtujte praktično delo

1. Preučite kulturne lastnosti kolonij, gojenih na MPA (pregled posevkov iz prejšnje lekcije)

2. Odsejte izolirano kolonijo (čista kultura) (v progah) na akumulacijski medij (naklon MPA)

3. Preučite in skicirajte vzorce rasti različnih bakterij na preprostih in kompleksnih hranilnih gojiščih

4. Izpolnite tabelo »Razvrstitev mikroorganizmov po vrsti dihanja«

5. Rešite situacijske probleme

Pomembna stopnja bakteriološke raziskave je kultura. Odvisno od namena študije, narave semenski material in mediji uporabljajo različne metode setve. Vsi vključujejo obvezen cilj: zaščititi psa pred tujimi mikrobi. Zato morate delati hitro, vendar brez nenadnih gibov, ki povečajo zračne vibracije. Med setvijo se ne morete pogovarjati. Setev je najbolje narediti v škatli (pri delu z infektivnim materialom morate upoštevati pravila osebne varnosti).

Faze izolacije čiste kulture:

1. dan - pridobivanje izoliranih kolonij. Zalogo preskusnega materiala nanesemo na površino agarja v petrijevki z uporabo zanke, pipete ali steklene paličice. Lopatica se uporablja za vtiranje materiala v površino medija; Ne da bi žgali ali obračali lopatko, posejte v 2. in nato v 3. skodelico. Pri takšni setvi je v 1. skodelici veliko materiala in s tem tudi veliko mikrobov, v 2. skodelici manj, v 3. skodelici pa še manj.

Izolirane kolonije lahko pridobimo s setvijo v zanki. Da bi to naredili, se preučevani material emulgira v brozgi ali izotonični raztopini natrijevega klorida.

2. dan - preučite rast mikrobov na ploščah. V 1. skodelici je običajno neprekinjena rast - izolirane kolonije ne bo mogoče izolirati. Izolirane kolonije rastejo na površini agarja v 2. in 3. plošči. Preučujemo jih s prostim očesom, s povečevalnim steklom, pri majhni povečavi mikroskopa in včasih v stereoskopskem mikroskopu. Želeno kolonijo označimo z dna posode in jo ponovno nacepimo na poševni del agarja. Pridelki so postavljeni v termostat. (Samo izolirane kolonije je mogoče ponovno zasejati.)

3. dan - preučite vzorec rasti na poševnih agarjih. Naredijo razmaz, ga obarvajo in se prepričajo, da je kultura čista, jo začnejo preučevati. Tu se izolacija čiste kulture konča. Kultura, izolirana iz določenega vira in preučena, se imenuje "sev".

Pri izolaciji čiste kulture iz krvi (hemokultura) jo najprej »vzgojimo« v tekočem gojišču: 10-15 ml sterilno odvzete krvi nacepimo v 100-150 ml tekočega gojišča. To se naredi zato, ker je v krvi običajno malo mikrobov. Razmerje cepljene krvi in ​​hranilnega medija 1:10 ni naključno - tako dosežemo redčenje krvi (nerazredčena kri škodljivo vpliva na mikroorganizme). Inokulirane bučke se postavijo v termostat. Po enem dnevu (včasih po daljšem času, odvisno od kulture, ki jo izoliramo) vsebino bučk nacepimo na plošče, da dobimo izolirane kolonije. Po potrebi ponovite setev v intervalih 2-3 dni.

Pri izolaciji čiste kulture iz urina, izpiranja želodca in drugih tekočin jih najprej centrifugiramo v aseptičnih pogojih in usedlino nacepimo. Nadaljnja izolacija čiste kulture poteka na običajen način.

Izbirni mediji se pogosto uporabljajo za izolacijo čistih kultur. Uporaba številnih metod biološke lastnosti sproščen mikrob. Na primer, pri izolaciji bakterij, ki tvorijo spore, pridelke segrevamo 10 minut pri 80 °C in s tem uničimo vegetativne oblike. Pri izolaciji povzročitelja tuberkuloze, ki je odporen na kisline in alkalije, se s pomočjo teh snovi semenski material osvobodi spremljevalnih! flora. Za izolacijo pnevmokoka in bacila kuge se proučevani material vbrizga v bele miši - v njihovem telesu, ki je zelo občutljivo na te patogene, bi se ti mikro-] razmnoževali hitreje kot drugi.

Pri raziskovalnem delu, predvsem v gene-; V znanstvenih raziskavah je treba pridobiti kulture naenkrat iz ene celice. Takšna kultura se imenuje "klon"] Za njeno pridobitev se najpogosteje uporablja mikromanipulator - naprava, opremljena z instrumenti (igle, pipete) mikroskopske velikosti. Z držalom pod nadzorom mikroskopa jih vnesemo v pripravek »B stota kapljica«, želeno celico (eno) odstranimo in prenesemo na hranilno gojišče.

Študija izbranih poljščin

Študij morfologije, gibljivosti, tinktorialnih lastnosti, vzorcev rasti na gojiščih (kulturne lastnosti);! encimsko aktivnost in številne druge lastnosti! razdeljen mikrob nam omogoča, da ugotovimo njegovo taksonomsko | nek položaj, tj. razvrstite mikroorganizem: op| razdeli njegov rod, vrsto, tip, podtip, sorto. To se imenuje "identifikacija". Identifikacija mikroorganizmov| mov zelo pomemben pri diagnostiki okužb, vire in poti njegovega prenosa ugotavljajo v številnih drugih znanstvenih raziskavah.

PRIDOBIVANJE ČISTIH KULTUR.

Čista kultura mikrobov je populacija mikroorganizmov ene vrste, pridobljena iz izolirane mikrobne kolonije. Mikrobna kolonija se nanaša na potomce bakterij, ki izhajajo iz razmnoževanja ene mikrobne celice.

Izolacija čiste kulture mikrobov je obvezna faza vsake bakteriološke študije. Čista kultura je potrebna za preučevanje morfoloških, kulturnih, biokemičnih in antigenskih lastnosti, katerih celota določa vrsto proučevanega mikroorganizma.

Podanih je bilo veliko predlogov za izolacijo čistih kultur mikrobov iz materialov, ki vsebujejo bogato mešano mikrofloro. različne metode. Najbolj razširjena metoda mehanskega ločevanja mikroorganizmov, ki se nahajajo v proučevanem materialu, da bi dobili izolirane kolonije na površini ali v globini hranilnega medija. Elektivna hranilna gojišča se pogosto uporabljajo za spodbujanje razvoja tistih mikroorganizmov, katerih čista kultura naj bi bila izolirana. Nekatere vrste mikrobov so zelo občutljive na določene okoljske dejavnike. Individualna odpornost mikrobov na enega ali drugega dejavnika je bila uporabljena za razvoj metod za izolacijo čistih kultur z ubijanjem spremljajoče mikroflore. Ta metoda se uporablja za izolacijo trosnih oblik mikrobov, ki so odporni na visoke temperature.

Znanih je razmeroma malo metod za izolacijo bakterij kot čistih kultur. To najpogosteje naredimo z izolacijo posameznih celic na trdnem hranilnem mediju z metodo streak plating.

Identične kolonije običajno rastejo iz čiste kulture, mikroskopija pa razkrije podobne celice, zlasti po velikosti in barvi po Gramu. Vendar so možne izjeme, na primer kolonije, ki rastejo iz čiste kulture, so lahko gladke (S) ali hrapave (R). Poleg tega se lahko v čistih kulturah različnih mikroorganizmov pojavijo kokoidne celice, ciste in spore. Nazadnje, nekateri mikroorganizmi kažejo variabilnost po gramu.

Setev s kapjo. Obstaja veliko metod za nanos črt na plošče, ki vsebujejo trdne medije (»vlečne plošče«), vendar le nekaj od njih skoraj vedno proizvede dobro izolirane kolonije, tudi če izvajalec poskusa ni vešč. Druga možnost je, da razredčene mešane raztopine kulture vlijete na površino trdnih gojišč v ploščah.

Pri delu z anaerobi se "izležene posode" ali posode s tekočo kulturo, vneseno vanje v zračni atmosferi, nato inkubirajo v anaerostatu. Anaerobi potrebujejo sveže pripravljena gojišča, v prvih 4 urah po avtoklaviranju pa je treba izvesti črtanje, da preprečimo kopičenje raztopljenega kisika.

1. Za označevanje na Zadnja stran Petrijevke s svinčnikom narišite črko T in dno razdelite na 3 sektorje.

2. S cik-cak zanko s kulturo nanesemo proge na površino agarja v sektorju 1. Za to najprej dvignemo pokrov posode in po nanosu proge takoj zapremo. Zanko steriliziramo na plamenu in pustimo, da se ohladi (15 s).

3. Narišite zanko vzdolž površine medija v sektorju 1 in nato takoj nanesite cikcakaste poteze na površino medija v sektorju 2. Zanko segrejte na plamenu in pustite, da se ohladi.

4. Narišite zanko vzdolž površine medija v sektorju 2 in nato z njo nanesite cikcakaste poteze na površino medija v sektorju 3.

5. Posode inkubirajte obrnjene na glavo, da voda, ki kondenzira s pokrova, ne pade na površino agarja. V sektorju 1 raste veliko število kolonij, v sektorjih 2 in 3 pa se pojavljajo posamezne dobro izolirane kolonije.

Pridobivanje čiste kulture s presejanjem v globino gojišča (po Kochu). Tri epruvete s po 15 ml mesnega peptonskega agarja postavimo v vodno kopel, da se agar stopi. Staljeni medij se ohladi na temperaturo 43-45°C. Ena bakterijska zanka preskusnega materiala se vnese v epruveto. Za boljše mešanje materiala z gojiščem večkrat zavrtite nacepljeno epruveto in jo držite med dlanmi. Nato se vsebina 1. epruvete s kalcinirano in ohlajeno zanko prenese v 2. in na enak način iz 2. v 3. epruveto. Pripravljene razredčine mikrobov prelijemo iz epruvet v sterilne petrijevke, označene s številkami, ki ustrezajo številkam epruvet. Ko medij s testnim materialom želira, damo skodelice v termostat. Število kolonij v ploščah s gojiščem se zmanjšuje, ko se material razredči.

Izolacija čiste kulture z metodo Drigalskega. Staljeni hranilni medij vlijemo v tri petrijevke. Zamrznjen medij je treba posušiti, saj njegova vlažna površina spodbuja nastanek zlivajoče se rasti. Eno kapljico testnega materiala dodamo v prvo skodelico in jo s sterilno lopatko vtremo v površino hranilnega medija. Nato se lopatica brez žganja skozi lopatico ali zbiranja novega materiala prenese v drugo in tretjo skodelico, pri čemer se preostali material na njej vtre v površino hranilnega medija. Metoda površinskega sejanja, ki jo je predlagal Drigalsky, je najpogosteje uporabljena metoda za pridobivanje čiste kulture mikrobov. Namesto lopatice lahko uporabite zanko. Material na hranilnem mediju se porazdeli v vzporednih potezah po celotni skodelici v eno smer. Nato z obračanjem skodelice za 180° naredimo udarce v smeri, ki je pravokotna na prve udarce. Pri tem načinu setve se material na zanki porablja postopoma, ob koncu setve pa se vzdolž mrežnih črt, ki so zarisane, razvijejo posamezne kolonije mikrobov.

Znanih je razmeroma malo metod za izolacijo bakterij kot čistih kultur. Najpogosteje se to izvede z izolacijo posameznih celic na trdnem gojišču z uporabo metode streak plating ali z vlivanjem majhne količine tekoče kulture v plošče ( metoda omejevanja redčenja). Vendar pridobitev ločene kolonije ne zagotavlja vedno čistosti kulture, saj lahko kolonije rastejo ne samo iz posameznih celic, ampak tudi iz njihovih grozdov. Če mikroorganizmi tvorijo sluz, potem so nanj pogosto pritrjene tuje oblike. Za čiščenje je bolje uporabiti neselektivno gojišče (NSM), saj se na njem kontaminantni mikroorganizmi bolje razvijajo in jih je lažje odkriti.

Pridobivanje izoliranih kolonij na trdnem hranilnem mediju dosežemo bodisi s presejanjem suspenzije mikroorganizmov z lopatico ( Kochova metoda) ali z uporabo bakteriološke zanke ( metoda kapi zaradi izčrpanosti). Zaradi mehanskega ločevanja celic mikroorganizma lahko vsaka od njih povzroči izolirano kolonijo ene vrste mikroba.

Sejanje z lopatico (Kochova metoda) proizvedeno v naslednjem zaporedju:

1) kapljico obogatitvene kulture nanesemo na površino hranilnega medija v posodo št. 1 s sterilno pipeto in porazdelimo s sterilno lopatico;

2) vzemite lopatko, hitro zaprite skodelico in prenesite lopatko v skodelico št. 2, ne da bi jo sterilizirali. Simulirajte porazdelitev kulture po celotni površini gojišča tako, da se njegove površine dotaknete z isto stranjo lopatice, ki je bila prej uporabljena za porazdelitev vzorca;

3) popolnoma enaka dejanja se izvajajo v skodelici št. 3, po kateri se lopatica sterilizira;

4) posejane posode postavimo v termostat in inkubiramo pri optimalni temperaturi.

Po določenem času skodelice odstranimo iz termostata in preučujemo rast mikroorganizmov. Običajno opazimo stalno rast bakterij v skodelici št. 1, kolonije pa opazimo v naslednjih skodelicah.

Sejanje z zanko (metoda drenažnih prog) vključuje sejanje bakteriološke zanke iz obogatitvene kulture na površino agarskega medija v petrijevkah. Na prvi stopnji se z zanko s kulturo nanese niz vzporednih potez na gojišče agarja (slika 4.2, A). Zanko steriliziramo, ohladimo na nenacepljenem delu agarskega gojišča in naredimo vrsto potez v smeri, ki je pravokotna na prve (slika 4.2, B). Nato zanko ponovno steriliziramo, ohladimo in nanesemo poteze v smeri IN(Slika 4.2) in po naslednji sterilizaciji - v smeri G(Slika 4.2). Skodelice postavimo v termostat in po določenem času rezultate upoštevamo. Običajno na udarcih A in B raste veliko število kolonij (včasih neprekinjena rast), medtem ko na kapi IN in G nastanejo izolirane kolonije.

Slika 4.2 – Shema progastega sejanja bakterij za pridobitev izoliranih kolonij

Serijske razredčitve v trdnem mediju- najenostavnejša metoda sejanja plošč, ki je sestavljena iz dejstva, da se po inokulaciji vzorca v epruveto s sterilno stopljenim in ohlajenim agarjem medij premeša, vlije v petrijevko in pusti, da se strdi. Za pridobitev dobro izoliranih kolonij pripravite niz zaporednih desetkratnih razredčitev in dodajte 1 ml vzorcev neposredno v skodelico, dodajte 15–20 ml staljenega agar gojišča in premešajte s stresanjem skodelice. Včasih so posamezne kolonije potopljene v agar in jih je mogoče odstraniti le mehansko. Slabo je tudi, da bakterije nekaj časa preživijo v okolju s temperaturo staljenega agarja.

Izolacija čiste kulture

Glavna metoda za izolacijo čistih bakterijskih kultur je metoda, ki jo je predlagal R. Koch, katerega princip je pridobitev kulture bakterij iz izoliranih kolonij. Pri izolaciji čiste kulture aerobov se obogatitvena kultura ali proučevani material poseje na trden hranilni medij. Postopek delovanja je naslednji. Stopljeni hranilni medij vlijemo v sterilne petrijevke. Ko se medij strdi, na njegovo površino nanesemo kapljico testnega materiala in s sterilno lopatico Drigalsky kapljico porazdelimo najprej po eni strani površine hranilnega medija v petrijevki, nato pa po drugi strani. Z isto lopatico obrišemo površino gostega medija v 2., 3. in 4. skodelici. Posode inkubiramo na optimalni temperaturi za mikrobe (najpogosteje 37°C) do 2 dni. Običajno opazimo kontinuirano rast mikrobov v prvih dveh posodah po inkubaciji, medtem ko opazimo izolirane kolonije v naslednjih posodah.

Obogatitveno kulturo je mogoče razpršiti z metodo redčenja. V tem primeru z zanko izberemo obogatitveno kulturo ali njeno razredčitev in v določenem vrstnem redu potegnemo proge skozi gost hranilni medij v petrijevki. Pred vsakim novim potegom se zanka sterilizira. Posode termostatiramo 1-7 dni, odvisno od stopnje rasti mikroorganizma. Zrasle izolirane kolonije presejemo z metodo prog v epruvete na površino poševnega medija ali v tekoči medij.

Z globoko inokulacijo pridobimo izolirane kolonije anaerobov in fakultativnih anaerobov. V ta namen 0,5-1,0 ml razredčine testnega materiala nacepimo v epruvete s staljenim hranilnim medijem, ohlajenim na 40-37 °C, tako da dobimo izolirane kolonije. Medij hitro ohladimo in površino prekrijemo s plastjo sterilne mešanice parafina in vazelina. Uporabite lahko kapilarne Pasteurjeve pipete, v katere naberete ustrezno razredčino agarnega gojišča z inokulacijo. Konec kapilare je zaprt. Z dobro izbrano razredčino zrastejo izolirane kolonije v epruveti ali pipeti. Da jih odstranimo, epruveto (ali pipeto) nekoliko segrejemo tako, da jo hitro zavrtimo nad plamenom gorilnika ali jo na hitro potopimo v toplo vodo, medtem ko se agar ob steni stopi in vsebina kolone zlahka zdrsne ven v sterilno Petrijevka. Kolone agarja prerežemo s sterilnim skalpelom in kolonije odstranimo tako, da jih zajamemo s sterilno kapilarno pipeto ali zanko. Ekstrahirane kolonije prenesemo v tekoče gojišče, ugodno za razvoj izoliranih mikroorganizmov. Če v kapilari dobimo izolirane kolonije, jo po temeljitem razkuževanju pretrgamo s sterilno pinceto in dele kapilare, ki vsebujejo izolirane kolonije, prenesemo v sterilno okolje.

Določanje čistosti izolirane kulture

Čistost kolonij, presejanih na poševnem agarju, je mogoče preveriti na več načinov: vizualno, mikroskopsko in z nasaditvijo na več hranilnih gojišč. Med vizualnim pregledom je rast mikroorganizmov vidna vzdolž črte na površini poševnega hranilnega medija. Če rast vzdolž linije ni enakomerna, se šteje, da je pridelek okužen. Takšno zatiranje pa je možno le za pridelke, ki lahko rastejo na površini trdnih hranilnih gojišč. Zato je treba čistost kulture spremljati pod mikroskopom. Če želite to narediti, pripravite pripravek obarvanih celic in si ga oglejte pod potopom. Čista kultura mora biti morfološko homogena in ima lahko le majhne razlike v velikosti celic.

Določanje sistematičnega položaja bakterij vključuje preučevanje niza značilnosti: morfoloških, kulturnih in fiziološko-biokemičnih.

Kulturne značilnosti

Kulturne ali makromorfološke značilnosti vključujejo značilne lastnosti rasti mikroorganizmov na trdnih in tekočih hranilnih medijih.

Rast na trdnih hranilnih gojiščih.

Na površini gostih hranilnih medijev lahko mikrobi rastejo v obliki kolonij, prog ali neprekinjenega travnika. Kolonija je izolirana zbirka celic iste vrste, ki v večini primerov raste iz ene same celice. Glede na to, kje so se celice razvile, ločimo površinske, globoke in spodnje kolonije. Kolonije, ki rastejo na površini gojišča, so zelo raznolike. Pri njihovem opisu se upoštevajo naslednje značilnosti:

oblika kolonije- okrogle, v obliki amebe, nepravilne, rizoidne itd.;

površina kolonije- gladka, hrapava, žlebasta, nagubana, nagubana, radialno progasta, s koncentričnimi krogi;

profil kolonije- ravna, izbočena, v obliki kraterja, stožčasta, izbočena v sredini z grebenom ob robu, vdolbina v sredini, z grebenom ob robu itd.;

sijaj in preglednost- sijoče, mat, motne, pudraste, prozorne;

barva kolonije- brezbarvne (umazano bele kolonije so razvrščene kot brezbarvne) ali pigmentirane - bele, rumene, zlate, oranžne, lila, rdeče, črne. Posebej omembe vredno je sproščanje pigmenta v podlago;

robu kolonije- gladke, valovite, nazobčane, resaste, korenaste itd.;

struktura kolonije- homogena, drobno- in grobozrnata, črtasta (rob in struktura kolonije se določita s povečevalnim steklom ali pri majhni povečavi mikroskopa);

konsistenca kolonije- določimo ga tako, da se kolonije dotaknemo z zanko. Kolonijo je mogoče enostavno odstraniti iz agarja, je gosta, mehka, raste v agar, sluzasta (prilepi se na zanko), viskozna, filmska (odstranjena v celoti), krhka.

Globoke kolonije so precej monotone. Najpogosteje izgledajo kot sploščena leča, v projekciji imajo obliko oval s koničastimi konci. Kolonije nekaterih bakterij spominjajo na snope vate z nitastimi izrastki v mediju. Nastajanje globokih kolonij pogosto spremlja zlom gostega medija, če mikrobi proizvajajo pline. Spodnje kolonije najrazličnejših mikroorganizmov izgledajo kot tanki prozorni filmi, ki se širijo po dnu.

Velikost in nekatere druge značilnosti kolonij se spreminjajo s starostjo in so odvisne od sestave gojišča, zato so pri opisu navedene starost kulture, sestava gojišča in temperatura gojenja.

Pri opisu rasti mikroorganizma s potezo opazimo naslednje značilnosti: rast je skromna, zmerna ali obilna, neprekinjena z gladkim ali valovitim robom, jasno vidna, podobna verigam izoliranih kolonij, razpršena, pernata, drevesna ali rizoidna. . Označite optične lastnosti plaka, njegovo barvo, površino in konsistenco.

Rast na tekočih hranilnih gojiščih.

Razlikovati naslednje oblike rast bakterij na tekočih hranilnih gojiščih:

Motnost medija. Takšna rast je značilna za mnoge patogene mikrobe, ki spadajo v skupino fakultativnih anaerobov.

Spodnja rast. Zanj je značilna tvorba usedline na dnu epruvete. Lahko je malo ali obilno, drobtinasto, homogeno, vlaknasto ali v obliki velikih ohlapnih kosmičev. Konzistenca usedline je lahko viskozna, sluzasta, krhka ali pastozna. Če kultura ne tvori pigmenta, se barva gojišča ne spremeni in usedlina postane sivkastobela ali rumenkasta. Za bakterije z anaerobnim dihanjem je značilna rast na dnu.

Parietalna rast bakterij se izraža v tem, da hranilni medij v epruveti ostane prozoren. Bakterije rastejo v obliki velikih ohlapnih kosmičev ali kompaktnih zrn, pritrjenih na notranjo površino sten epruvete.

Površinska rast bakterije je značilen pojav filma na površini tekočega hranilnega medija. Film je lahko tanek, brezbarven, ob stresanju ali tresenju izgine, moker, viskozen, sluzast, gost, suh, ko mu vzamemo material, pa ga lahko v celoti odstranimo v obliki okroglega diska. Pogosto rast mikroorganizmov v tekočem hranilnem mediju spremlja pojav plina in vonja.